胚胎解冻后在m-pbs中一步解冻。胚胎在体外培养或直接移植到受体母亲不解冻。结果表明，1.8m乙二醇组的体外存活率和妊娠率明显高于1.6m丙二醇组（分别为84.8%和65.5%，48.5%和40.0%）（P<0.05），但1.4m乙二醇组与对照组差异无显著性（分别为84.8%和86.7%，48.5%和50.0%）（P>0.05），这是胚胎移植技术在商业条件下应用最有价值的方法。第e传统的冷冻方法通常是在胚胎解冻后用蔗糖溶液一步一步地去除冷冻保护剂，而直接移植法简化了胚胎移植前的处理，不仅可以消除去除冷冻保护剂带来的技术误差，而且还具有操作简单、省时省力、不需要专用设备和设备的优点，就像试管冷冻精液授精一样，胚胎解冻后可立即移植。实现上述目标的关键是寻找一种对胚胎具有高渗透性的抗冻剂，使解冻后的胚胎直接复水，获得高活力。出于这个原因，有些人使用甘油和甘油用于一步解冻的蔗糖混合物（massip等人，1984年）和其他人使用丙二醇（Suzuki等人，1992年）作为防冻剂来冷冻牛胚胎。解冻后，它们直接在PBS中再水化以除去防冻液。杨念生等（1996）还对胚胎防冻液一步去除的冷冻方法进行了深入的实验研究。然而，到目前为止，大多数研究都是利用牛体外受精胚胎。在我国，用不同抗冻剂冻融后直接移植具有良好骨受精能力的胚胎的效果鲜有报道。研究了乙二醇或丙二醇作为冻融保护剂对冻融过程的影响牛体外培养及生产条件下直接移植

1材料与方法

1.1胚胎的体内生产

以天津奶牛繁育站饲养的荷斯坦奶牛为供体。自然发情9～13d后，用中国科学院动物研究所研制的FSHP和上海市计划生育研究所的PG进行超排。美国和加拿大纯种公牛发情超排后，用冷冻精液受精2～3次。在授精后的第7天或第8天，用全封闭自动洗卵器（FHK，日本，富士平）进行非手术取卵工业公司）。回收的卵母细胞冲洗液经孔径为0.75的胚胎过滤器过滤μ m、 将少量残液置于20～40倍固体显微镜下进行胚胎检测，并在Nikon倒置显微镜下进行形态学分类评价胚胎质量。取A级或B级致密桑椹胚或囊胚进行冷冻试验（

1.2胚胎在含20%FCS（胎牛血清）的m-pbs溶液中洗涤3次，然后冷冻解冻（

（1）直接移植：按两种抗冻剂分为两组：第1组：1.8M乙二醇（eg）；② 6 m丙二醇（PD）。在室温下，胚胎一步转移到1.8M乙二醇+m-pbs+20%FCS或1.6M丙二醇+m-pbs+20%FCS中，然后装入0.25mL塑料管。胚胎在冷冻液中与冷冻前的平衡时间为10-20分钟。在-7℃, 将胚胎直接放入程控低温仪（ET-1，FHK，富士平实业公司）的精子喷淋浴中。2分钟后，胚胎被冰种植并停留在-7℃ 8分钟。然后，温度降低到-30℃ 以0.3的速度℃ / 取胚管置于液氮中保存。解冻时，从罐中取出试管，在空气中停留5-10秒，立即解冻再过30分钟℃ 水浴（直至冰晶消失），将胚胎直接注入含m-pbs+20%FCS溶液的培养皿中，15min后冲洗2次（

（2）常规方法（对照组）：所用防冻液为1.4m甘油（Gly）。在室温下，将胚胎移植到0.5m、1.0m和1.4m甘油+m-pbs+20%FCS中，每一步持续10min。然后，将胚胎移植到1.4m甘油冷冻溶液中10分钟。然后，将胚胎放入1.4m甘油冷冻溶液中10分钟。在-5.3℃, 将胚胎直接放入冷冻室，冰种植和冷却程序与方法1相同℃ 水浴，em将苔藓转移到1.0 M甘油+0.3 M蔗糖、0.5 M甘油+0.3 M蔗糖和0.3 M蔗糖+M-pbs+20%FCS的解冻溶液中，一步一步去除防冻液10分钟。最后，用m-pbs+20%FCS溶液（

1.3）洗涤两次，进行体外培养和胚胎活力评价。各组胚胎移植于预先覆盖矿物油的TCM-199+20%FCS培养液中，置于CO2培养箱（温度38℃）℃); 培养24-48小时后，下一阶段形态良好的胚胎判定为活胚（

1.4）移植及妊娠诊断：受体来自静海县奶牛项目办实验奶牛场以及一些由市奶牛发展中心饲养的成年荷斯坦奶牛。选择PG处理后自然发情或同期发情、生殖器官正常、黄体发育良好的奶牛为受体。解冻后直接移植胚胎，不去除冷冻保护剂；在逐步去除冷冻保护剂后，按常规手术将后者植入子宫角深部。结果与结论：共冷冻保存胚胎191枚，解冻培养96枚。各组48小时后胚胎发育情况见T表1

表1不同冷冻方法和不同抗冻剂

冷冻方法冻融后胚胎体外培养结果抗冻剂种类

及其浓度冻融

胚胎数冻融

胚胎数存活

胚胎数成活率（%）

直接转入1.8m乙二醇34 33 28 84 8（a）

种植法1.6m丙二醇32 29 19 65.5（b）

常规法1.4m甘油30 30 30 26 86.7（c）

注：卡方检验：a和BP<0.05，a和CP<0.05<0.05

1.8m乙二醇组冻融胚胎存活率显著高于1.6m丙二醇组（84.8%vs65.5%，P<0.05）。但与对照组相似（86.7%，P>0.05）。冷冻保护剂对牛胚胎的渗透性直接影响胚胎的损伤程度。许多人报道用乙二醇、丙二醇和甘油与蔗糖混合作为防冻剂冷冻牛胚胎，解冻后直接在PBS中复水，一步除去防冻剂的效果。杨念生等（1996）证明，以乙二醇或甘油+蔗糖为防冻剂的牛体外受精胚胎一次除冻后的孵化率显著高于丙二醇（分别为73.24%和77.27%）；后者为47.9%。结果表明，在体外用1.8M乙二醇冷冻牛胚胎并在m-pbs中解冻，其存活率（84.8%）显著高于1.6M丙二醇组（65.5%），与杨念生等相似，同时乙二醇不仅适用于活体胚胎的冷冻，但也优于丙二醇（

2。2为了确定乙二醇或丙二醇冻融胚胎在母体中的发育速度，比较了直接移植在生产条件下的效果。共解冻胚胎95枚，移植胚胎91枚，其中妊娠42枚。妊娠率为46.2%。不同冷冻保护剂的结果见表2（

表2不同冷冻方法使用不同冷冻保护剂对体内胚胎移植

冻融效果冷冻方法冷冻保护剂种类

及其浓度解冻

移植胚胎数

受体数妊娠率

（%）

直接注入1.8m乙二醇33 16 48.5（a））

注入1.6m丙二醇30 30 12 40.0（b）

常规方法1.4m甘油32 28 14 50.0（c）

注入卡方检验：a和b P<0.05，a和c P>0.05

使用1.8m乙二醇作为防冻剂，解冻后直接移植妊娠率为48.5%，明显高于1.6m丙二醇组的40.0%(P<0.05），但与对照组（1.4m甘油）的50.0%相比无显著性差异（P>0.05）。这与唐迪秀（1996）在生产条件下的大组试验结果一致，即1.6m丙二醇组的妊娠率低于1.8m乙二醇组或1.4m甘油组（对照组），但乙二醇组和甘油组（

2.3）之间没有显著差异，以乙二醇为抗冻剂，采用直接移植法冻融牛胚胎，其体外和体内发育率与甘油冷冻分配复水常规法相似，但前者简便易行适合大规模应用。因此，乙二醇是一种有效的冷冻保护剂，在生产条件下直接移植冷冻牛胚胎是可以接受的（

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