家禽传染病的病原学诊断：细菌培养和初步鉴定
（1） 染色显微镜
① 涂片的制备
固体培养物（平板、斜面）或脓、粪等涂片的制备：取1滴带接种环的生理盐水，置于制备好的载玻片上，再取少量带灭菌接种环的培养物，滴入水中混合，混合均匀，涂膜，使其显得非常轻微的混浊，剩余的材料在火焰上灭菌（
液体培养物的制备或血、尿、渗出液、牛奶等涂片：直接取一个或几个环用灭菌接种环进行试验，并将其置于载玻片上作涂片（
组织与脏器物质接触的准备：取一小块标本取软组织，用其切割面在载玻片表面轻轻触摸几次。注意不要触摸太重或太厚，让它自然干燥，形成组织接触（或印刷）。也可用于轻轻接触载玻片表面，移动组织块制作涂片，涂片可自然干燥（
② 干燥固定：涂片（接触物）在室温下自然干燥后，涂片表面向上，涂片背面通过酒精灯火焰数次，然后再稍微加热（但不要太热，以免烫伤手背）。血液、组织和内脏涂片（尤其是Giemsa染色）通常是用甲醇固定。干燥后的涂片可浸入含甲醇的染缸中，取出晾干，也可在涂片中加入几滴甲醇，使涂片在自然干燥前工作3-5分钟（
③ 染色：固定涂片或涂片可染色。常规染色方法为革兰氏染色。基本工艺是：染色→ 媒染→ 脱色→ 复染→ 烘干→ 镜检（
染色：在涂层和抹灰表面干燥固定的涂片中加入草酸铵结晶紫溶液，染色2-3分钟，用水（
媒染洗涤，加入克碘溶液2-3分钟，用水洗涤（脱色时间应控制）根据抹灰面厚度灵活调整，一般在20～60秒之间，用水冲洗（
加几滴稀释的石炭酸发红液或砂黄液，染色1～2分钟，用水冲洗（
干燥吸水纸或自然干燥。使用显微镜时，应放在稳定、便于采光的实验台或平台上（电光显微镜除外）。将聚光器尽可能升高，放大光圈，调整反射器，使进入透镜的光线最强（
在待检样品上加1滴沥青，将样品固定在台中心，用油镜检查。F首先，从管子的侧面看油镜。小心地转动粗调器，使滑块和镜筒彼此靠近，直到油透镜浸没在油中并几乎与滑块接触，但不要接触滑块。然后，在目镜观察的同时，慢慢转动粗调器，使镜筒与滑块之间的距离慢慢变远。当获得模糊的目标图像时，精细调节器被替换，直到目标图像完全清晰为止。此时，不要用粗调器使油镜靠近滑块，以免挤压滑块而损坏油镜。使用完油透镜后，用透镜清洁剂擦去透镜上的雪松油g纸片（
革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色（
（2）分离
右手持接种环，在酒精灯上燃烧灭菌。冷却后，可采用无菌手术取病料。如为液体病料，可直接用灭菌接种环取一圈病料；如果是固体病料，首先用酒精灯对手术刀进行消毒，立即用手术刀对病料表面进行灼烧消毒，然后用消毒接种环（
托住平板，从组织烧伤部位取出内病料用左手平放，用拇指、食指和中指打开板盖（角度要平滑，但角度要小，以免空气中的细菌污染培养基），将受试物的接种环伸入板内，涂在培养基的一侧，然后用自抹部的腕力在钢板表面轻轻划出线条，且线条可中断，也可用于连续划线。第一组可标记1-3次。将环上多余的细菌物质烧掉后，从第一组标记中引出第二组标记，对接种环进行灭菌，然后对接种环进行消毒第二组标记引出第三组标记。重复3-4组打标后，整个板面即可填充。一组划线的起点只能与相邻的前一组划线重叠，以便在最后1-2组划线上出现大量的单菌落进行纯培养（
标记后，烧接种环，盖上平板，用玻璃笔在盘子底部标出材料和日期，把盘子倒成37英寸的形状℃ 培养箱培养18-24小时后观察结果（
（3）纯培养
选择可疑菌落进行染色和显微镜检查，并在适当的斜面上接种同时（
（4）生化实验
细菌有自己的酶系统，因此它们都有自己的分解代谢产物和合成代谢产物，这些产物是鉴定细菌的基础。所谓细菌生化试验，就是用生化的方法检查细菌的代谢产物。这个实验有很多方法。常用的方法有：
糖发酵实验。将纯培养菌接种于不同的糖培养基中，37℃培养℃ 1-7天。大多数细菌能在24小时内观察到结果。培养基变黄；产酸产气⊕ (介质变黄，出现气泡）；它不会分解-（培养基仍然是蓝紫色）(在
甲基红（MR）试验中，将纯培养菌接种于葡萄糖蛋白胨溶液中。培养4-5天后，向5.0 ml培养液中加入1-5滴甲基红试剂。红色为甲基红试验阳性，黄色为阴性
V-P试验，取2.0ml葡萄糖蛋白胨培养2～4d，先加6%葡萄糖α- 0毫升萘酚酒精液，然后0.4毫升40%氢氧化钾溶液。充分摇动试管。如果几分钟内呈红色，则为阳性。如果它是阴性的，应该放在一个37℃ 培养箱4小时。如果它呈红色，则为阳性。如果仍然无色，则为阴性（
吲哚试验（吲哚底物试验）接种细菌ria在蛋白胨水中进行检测，并在37℃培养℃ 培养箱1-2天。向培养基中缓慢加入0.5-1.0mL吲哚底物试剂，不摇动，形成两层明显的层，即试剂在培养基上重叠。注意培养物与试剂界面的变化。试剂呈红色，吲哚试验阳性，硫化氢试验无变化（
，细菌纯培养液经穿刺接种于醋酸铅琼脂或三糖铁琼脂中，37℃培养℃ 1-2天。在枸橼酸利用试验中，如沿穿刺线呈深褐色，则视为硫化氢阳性反应（
，将细菌制成生理盐水悬液，于在柠檬酸钠琼脂斜面上接种，37℃培养℃ 持续4天。每天观察细菌生长情况。阳性菌生长，培养基由绿色变为蓝色；阴性未见培养基呈绿色（
根据可疑菌的生化特性，接种各种生化培养基进行生化试验，观察其生化反应特性。必要时可进行血清学试验（
（5）动物致病性试验
将24小时肉汤培养的细菌接种到实验动物体内，并根据上述试验结果观察致病性数天（
（6），病原菌的种类和名称可以确定（
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