在卵母细胞和胚胎的体外培养过程中，细胞处于相对较高的氧气环境中，往往由于抗氧化防御不足而导致氧化应激，使细胞在发育过程中积累大量的活性氧物种，从而降低卵母细胞和胚胎的体外发育率。褪黑素作为一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，能显著降低细胞内ROS水平，清除细胞内自由基，促进卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育。让我们进一步了解褪黑素对肉羊体外胚胎生产的影响（

1.材料和方法

1.1实验材料屠宰的绵羊卵巢来自绵羊屠宰场。屠宰后的羊卵巢被切除后，立即置于添加双抗体（1000lu/ml）的30℃生理盐水中，在2H内运回实验室（

1.2主试剂

（1）取卵液：TCM199（HEPES）+10%胎牛血清（FBS）+6IU/ml肝素+100IU/ml绿色链霉素

（2）成熟培养基：TCM199+10%FBS-10G/ml卵泡刺激素（FSH）-lug/ml雌二醇（E2）+10ug/ml黄体生成素（LH）+10ng/ml表皮生长因子（EGF）+0.1mmol/L半胱氨酸+1%PS

（3）接受精液：sof+6mg/ml BSA+20ul/ml肝素钠+1%PS

（4）enab灵液：s（F+3 mg/ml BSA-2 mg/ml+1%PS

（5）胚胎培养液I:sof-3 mg/ml BSA-1%PS

（6）胚胎培养液II:sof-10%FBS+1%PS

1.3方法和步骤

1.3.1从屠宰场收集卵母细胞

并带回绵羊卵巢送至实验室，用无菌生理盐水冲洗3次。从卵巢表面直径2~8mm的卵泡中提取卵泡液，在体视显微镜下选择完整的卵丘细胞，检测具有均匀细胞质的卵丘卵母细胞复合体（C（CS）

1.3.2卵母细胞体外成熟率的统计

24小时成熟的卵母细胞用O.L%培养和消化透明质酸酶去除卵丘细胞。在体视显微镜下观察计数第一极体排泄率（即卵母细胞成熟率）1.3.3囊胚细胞计数

取体外受精第7天培养的4～5个囊胚进行核染色。具体步骤如下：用PBS/PVP清洗囊胚三次，用酸性桌面溶液去除囊胚透明带，用PBS/PVP清洗囊胚三次，缓慢移入3.7%多聚甲醛中，室温固定3min，然后用PBS/PVP清洗囊胚三次，放入配制好的hoechst333/12染料溶液10 UG/ml中10min，最后用PBS/PVP清洗三次，放置blas将囊胚细胞置于载玻片中心，按压并密封载玻片，在倒置荧光显微镜下拍摄囊胚细胞并计数数天。1.4数据处理

重复试验3次。采用Excel 2003软件建立数据库，对测试数据进行整理，并用spss17进行单因素方差分析。O软件。结果用平均值±标准差表示，P<0.05作为差异显著性的判断标准（

2.实验结果

2。。1褪黑素对肉羊卵母细胞成熟率（第一极体排泄率）的影响

10-Ⅱ 在卵母细胞体外成熟液中加入lol/L和lo-SMOL/L褪黑素，体外成熟的牛卵母细胞成熟率显著高于对照组和10-10mol/L褪黑素处理组（P<0.05），但两组间无显著性差异（P>0.05）。10-1mol/L褪黑素治疗组与对照组之间无显著性差异（P>0.05）（

2。。2褪黑素对体外受精胚胎

发育的影响不同浓度的褪黑素（lo-10mol/L、10-9mol/L、lo-SMOL/L）对体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率有不同的影响。褪黑素组与对照组比较有显著性差异（P<0.01），褪黑素组与对照组比较有显著性差异（P<0.01）褪黑素组与10-10褪黑素组间差异有统计学意义（P<0.05）。两组囊胚率差异无统计学意义（P>0.05）。不同浓度褪黑素组囊胚细胞数无显著性差异（P>0.05），但褪黑素治疗组凋亡细胞比例明显低于对照组（P<0.05）。褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

在卵母细胞体外成熟过程中，氧化应激反应持续发生，而在卵母细胞体外成熟过程中，褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响卵母细胞的生长和成熟，卵巢中不断产生抗氧化应激物质以清除过氧化物。体外氧化损伤可导致卵母细胞发育停滞和卵母细胞体外成熟质量下降。本研究表明，在体外成熟过程中，外源性抗氧化剂褪黑素的适宜浓度为10-91 tiol/L，卵母细胞成熟率最高，卵裂率、囊胚率和囊胚活细胞数均显著高于对照组。过高的浓度会对细胞产生毒性作用，过低的浓度不足以完全去除细胞氧化应激产生的过氧化物，但它比t对照组。褪黑素不仅具有抗氧化调节作用，而且有助于调节卵泡生长。3.2褪黑素对体外受精的影响

体外精液中添加褪黑素可显著降低精子细胞中的ROS水平。受精后，精子携带的代谢产物ROS可能会对卵母细胞的细胞质造成损害。人卵后氧化精子携带的脂质过氧化产物和DNA片段会破坏卵母细胞的细胞质，影响体外受精率和受精后囊胚的发育能力。精子在体外操作过程中会产生过多的活性氧，精浆中的部分抗氧化系统被清除在体外手术中，这会降低精液调节氧化还原平衡的能力。为了提高冷冻精子的体外受精能力，国内外许多研究者都引入了外源性抗氧化剂斯美拉通素，它能清除活性氧，激活多种抗氧化系统，保护精子膜脂质过氧化，延长精子存活时间，提高冷冻精子质量。大量精子聚集在成熟卵母细胞周围，会产生过量的自由基，影响体外胚胎发育能力。本研究表明外源性添加抗氧化剂褪黑素可以提高体外受精后体外胚胎的卵裂率（

3.3褪黑素对体外受精的影响体外发育胚胎的质量

早期胚胎发育对氧化应激非常敏感。由于体外胚胎缺乏抗氧化能力，过量的活性氧会对细胞结构和功能产生毒性影响，导致发育停滞和胚胎分裂。在体外条件下，胚胎内部调节机制的改变和外部环境的不适是导致胚胎发育受阻的根本原因（

本实验模拟体内环境，为科学研究和生产实践提供更多更好的胚胎。结果表明，在体外胚胎培养基中加入褪黑素可显著提高胚胎的成熟度e体外受精胚胎的卵裂率和囊胚发育率。不同浓度的褪黑素对体外受精胚胎细胞凋亡有影响。褪黑素具有抗凋亡作用，但与对照组相比无显著性差异。同时，高浓度的褪黑素会促进细胞凋亡（

4。结论

将褪黑素加入到体外胚胎产生的全过程中，可以促进发育相关基因的表达，最终显著提高卵母细胞胞质成熟的质量。提高体外受精胚胎的卵母细胞成熟率、卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数，减少受精率胚胎细胞碎片的t细胞转移和提高胚胎质量（

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