研究FSH对体外支持细胞ddx4和tpx1表达的影响，为进一步研究体外生精提供理论和实践依据。以培养的小牛支持细胞为实验材料，用不同浓度的FSH（0,0.01,0.02,0.04,0.08iu/ml）处理支持细胞。采用实时荧光定量PCR技术检测3个时间点ddx4和tpx1的表达。让我们了解更多！FSH对体外培养小牛支持细胞ddx4和tpx1基因表达的影响

支持细胞间紧密连接形成血睾屏障。血睾屏障将生精小管的生精上皮分为两部分：基腔a第二近腔。由于这两个腔室的微环境不同，在不同时期会影响生精细胞的发育，基底腔完成生精的起始阶段，在纤细期含有精原细胞和精母细胞。近腔区靠近细管的腔端，完成减数分裂，使生精细胞变形为成熟精子，包括发育中的生精细胞和精子细胞。此外，FSH和睾酮通过支持细胞在精子发生中起着重要的调节作用。Ddx4和tpx1由生精细胞产生。它们是精子发生所必需的蛋白质。关于它们是否被表达的报道很少在支持细胞（

中，本实验对支持细胞进行体外培养。通过FSH的作用，讨论了与精子发生相关的几个重要基因变化，即ddx4和tpx1，为体外生精研究提供理论和实践依据1.材料

犊牛睾丸在4小时内运回双城屠宰场。DMEM（吉布科）；乙二胺四乙酸二钠（Amresco）；胰蛋白酶250，Amresco 1；宁波第二激素厂；三唑试剂（哈尔滨英军生物有限公司）；Faststart universalsybr green master（Rox）（德国罗氏）；Easy-Taq酶，Primestar-HS（预混料），DNA标记，dNTP，oligoDT引物、各种核酸内切酶和RNase抑制剂（宝生物工程（大连）有限公司）；ImpromⅡ逆转录酶（Promega）；2×Taq-PCR-mastermix（北京天根公司）（

2.方法

2。。1以支持细胞制备

小牛睾丸组织为实验材料。用胶原酶和胰蛋白酶联合酶法将其分离成单细胞悬液，用差速贴壁法纯化支持细胞并进行体外培养。支持细胞纯度达95%以上。。2个经FSH处理的支持细胞

解冻培养。初始细胞密度为3.0×10-4个/ml，不同浓度的FSH随机分为5组：A组，0.oliu/mlfsh；B组，FSH浓度0.02iu/ml；C组，FSH浓度0.04iu/ml；D组，0.08iu/mlfsh，CK组（对照组）OIU/mlfsh

）

2。。取3个细胞

于3.0×10~2×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3×10~3。细胞粘附6小时后，用5种不同浓度的FSH培养基替换细胞，空白组用全介质代替，记录为OH。分别于6h、12h和24h，向每组三个待测孔中加入1mL三唑，吹气数次，收集细胞，转移至1.5mlep管中，-80℃

2的相对定量）。。4ddx4和tpx1基因

按Trizol说明书提取各组细胞总RNA。经检测分析，总RNA为反转录。根据Promega Improm II（Promega，Madison，WI，USA）试剂盒中描述的两步程序进行逆转录。为了检测FSH对基因表达的调控能力，通过实时PCRSee表1测定ddx4和tpx1的表达量和引物序列。引物由北京华大基因生物技术有限公司

3合成。讨论与分析

3.1

FSH对Sertoli细胞ddx4基因表达的影响，精子发生在fir前期被合子阻断st减数分裂，细胞凋亡，不能产生精子。显然，小鼠精子发生过程中合子的顺利完成依赖于ddx4基因的表达。结果表明，一定浓度的FSH可促进ddx4基因mRNA的表达。同时，支持细胞的紧密连接使曲细精管的基底区和近腔区处于不同的微环境中。近腔区是减数分裂产生的单倍体细胞。因此，支持细胞可通过FSH产生ddx4参与减数分裂，促进精子发生，ddx4可能是支持细胞近腔微环境中的一个减数分裂因子

3.2 FSH对支持细胞tpx1基因表达的影响细胞

tpx1是一种富含半胱氨酸的分泌蛋白，在男性生殖道和睾丸中特异表达。对tpx1生物学特性的研究表明，tpx1mrna在粗线期精母细胞中表达，并持续表达直至精子形成，同时tpx1蛋白也持续表达。Tpx1可作为精母细胞与其他防治细胞之间的分子桥梁。本实验表明，不同浓度FSH处理的支持细胞tpx1表达明显增加。推测支持细胞产生的tpx1参与了支持细胞与支持细胞之间的连接和功能传递结论在一定浓度范围内，FSH能显著促进ddx4和tpx1基因的表达。ddx4在12h左右表达最高，tpx1在24h左右表达最高

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