免疫酶组化法对试验感染雏鸭体内鸭肝炎病毒的分布测定
鸭病毒性肝炎（dick virus hepatitis，DVH）是一种在雏鸭中传播迅速、病程短、致死率高的传染病。主要病理改变为肝脏肿大和肝表面出血点。自从1945年莱文和霍夫斯塔德被发现以来，这种疾病已经在世界范围内传播。本实验以小鼠抗DHV抗体为第一抗体，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为第二抗体。建立石蜡切片DHV抗原的免疫组化检测方法。利用该方法对人工感染雏鸭不同组织器官中DHV的准确定位和分布进行了研究，为该病原菌的研究提供了依据鸭病毒性肝炎的发生（
1材料与方法
1.1试验鸭为合肥市某养鸭场1日龄DVH阴性樱桃谷鸭。孵化后不接种疫苗，隔离两天。6周龄雌性BALB/c小鼠由扬州大学实验动物部
提供 ?(
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1.2病毒r85952？为DHVⅠ型标准毒株，毒力为104.8ld50/0.1ml，试验前对雏鸭进行了复壮试验。肝毒素用生理盐水按1的比例稀释∶ 10，磨碎，冻融3次，3000r/min离心15m培养上清中分别加入1000iu青霉素和1000iu链霉素μ g） 在37℃ 培养箱1小时（
1.3小鼠抗DHV A66？DHV A66的制备？按文献中单克隆抗体制备方法免疫BALB/c小鼠。分离血清，检测抗体效价（
1.4供试血清及酶标抗体正常的BALB/c小鼠血清由安徽省医学科学院病毒实验室提供；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG是sigma公司
1.5石蜡切片DHV免疫组化技术建立的产物是的。样品固定于10%中性福尔马林中，脱水、透明、打蜡、包埋，每样制备3-5天μ 取2块以上厚1.5m的石蜡分别进行免疫酶复染和常规he染色。浸蜡干燥工艺控制在60℃以下℃（
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1.5.2免疫组化方法及结果测定切片按文献[4]程序进行免疫组化染色，然后用Harris苏木精染色，干燥，密封，显微镜下观察。如果受检组织局部细胞胞浆呈棕黄色，则判定为阳性（+），否则判定为阴性将判定为阴性（-）（
1.5.3测定小鼠血清和酶标抗体的工作浓度？取雏鸭肝脏典型病理改变作石蜡切片，作为阳性切片。高免疫血清用1∶ 4, 1 ∶ 8, 1 ∶ 16, 1 ∶ 32, 1 ∶ 64, 1 ∶ 128, 1 ∶ 分别为256。HRP标记的羊抗鼠IgG用1∶ 100, 1 ∶ 200, 1 ∶ 400, 1 ∶ 600, 1 ∶ 800, 1 ∶
1.5.4的特异性试验用上述感染的DHV r85952？以DHV阴性雏鸭肝切片为阳性抗原，以DHV阴性雏鸭肝切片为阴性对照。抗DHV阳性血清用生理盐水和正常BALB/c小鼠血清代替，酶标抗体作为二级抗体（
1.5.5用1000、2000、4000进行阻断试验，将dhva66
株尿囊液和无病毒鸡胚尿囊液分别与工作浓度的高免血清混合，浓度分别为800eid50/Ml。治疗后37℃ 1.6感染雏鸭DHV的检测300只3日龄雏鸭随机分为两组，对照组60只，实验组240只。每个an实验组皮下注射病毒上清液0.2ml，观察并记录临床表现及死亡情况。分别于攻击后6h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h处死实验组6只雏鸭和对照组3只雏鸭。取肝、脾、脑、心、肺、肾、胰、小肠等组织块用10%中性福尔马林固定，制成石蜡切片，检测DHV（
2结果
2.1高免血清和酶标抗体工作浓度的测定。基质染色结果见表1。根据实验结果，确定了最佳工作浓度血清抗体比为1∶ 64和1∶ 400分别（
表1高免血清和酶标抗体最佳工作浓度的测定（
2.2特异性试验结果DHV r85952？DHV株肝切片呈阳性，生理盐水、正常BALB/c小鼠血清代替抗DHV阳性血清和DHV阴性雏鸭肝切片呈阴性，说明所建立的免疫组化技术具有良好的特异性
2.3阻断试验结果为：1000、2000 eid50/但染色强度降低，4000、8000 eid50？Ml病毒剂量不能阻断染色反应上的病毒被完全阻断了，正常尿囊液呈强阳性（
2.4感染雏鸭组织器官中DHV检测结果不同感染时间雏鸭组织切片酶染色结果显示，感染6小时后肝细胞胞浆中出现棕黄色反应物，肾脏、小肠和脾脏部分切片的细胞质开始出现棕黄色反应物。12～16h肝、肾、肺、脾、小肠切片可见棕黄色反应物。24h时，心、脑组织中均可见棕黄色反应物。随着时间的延长，po的数量逐渐减少各组织中阳性细胞逐渐增多，胞浆反应物加深，呈褐色。试验结果见表2（
表2感染雏鸭组织器官DHV抗原动态检测结果（略）
3讨论（
3.1在组织抗原定位检测中，一般采用免疫荧光抗体技术和免疫酶组织化学技术。然而，免疫酶组织化学技术的敏感性和特异性不仅与荧光技术相当，而且结果可以长期保存。它可以在普通光学显微镜下观察，应用范围更广。间接过氧化物酶h以小鼠抗DHV高免血清为第一抗体，HRP标记羊抗小鼠IgG为第二抗体，建立石蜡切片DHV免疫组化检测方法。特异性试验和阻断试验表明，该方法具有良好的特异性，特别是组织经Harris苏木精染色后，DHV能在组织中准确定位，因此本研究建立的免疫组化技术特别适合于病毒抗原定位的研究，鸭病毒性肝炎
的动态分布及发病机理3.2根据实验感染雏鸭各组织器官中DHV抗原的动态检测结果，首次检测到DHV组织匀浆结合PAP法检测DHV滴度与dot-ELISA法检测结果一致。结果表明，DHV定位的第一靶器官是肝脏，其次是脾、肾、肺和肠。因此，DHV主要通过粪便排泄到体内，感染的主要途径可能是口腔感染。至于脑组织中DHV的检出较晚，可能是由于血脑屏障的作用。一旦病毒突破血脑屏障，到达脑组织，就会引起脑细胞病变但雏鸭在出现以弓状反射为主的神经症状后不久即死亡。有没有理由认为DHV毒力对雏鸭有致病性，因为病毒可以进入雏鸭的脑组织，有待进一步研究证实。另一方面，我们认为DHV可引起雏鸭急性肝炎并导致肝衰竭（肝昏迷），这是感染雏鸭发病和死亡的重要原因
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